抗原特异性T细胞增强染色实战宝典

流式细胞术结合肽-MHC（pMHC）多聚体分析抗原特异性 T 细胞群体已成为常规方法。很多试剂能够帮助追踪和表型分析感染、自身免疫及癌症过程中的 T 细胞，尤其在监测治疗干预效果时尤为显著。

最新进展显示使用高价多聚体(二聚体、四聚体、十二聚体等)可以增强染色效果，或加入针对 pMHC 多聚体的抗体同样“增强”染色效果。这些突破使得即使 pMHC 与 T 细胞受体之间的相互作用亲和力弱至 KD 超过 1mM （即比以往技术灵敏度高出20 倍以上），也能成功进行T 细胞染色。特别是在利用pMHC 多聚体检测抗癌或自身免疫性 T 细胞群体时，因为这些细胞通常表达亲和力较低的 T 细胞受体。

T 细胞的αβ T 细胞抗原受体（TCR）使 T 细胞能够通过检测细胞表面 MHC I 类或 II 类分子所承载的肽类抗原来识别蛋白质组中的异常情况。TCR 与肽-MHC（pMHC）之间的相互作用较为微弱，通常仅持续几秒钟。然而，可溶性 pMHC 的多聚化效应能显著延长这种相互作用的半衰期——这得益于“亲和力效应”——从而生成能够稳定结合到表达特异性 TCR 的 T 细胞表面的试剂。早在1996 年，Altman 等人首次利用基于亲和素-生物素系统的pMHC 四聚体来标记T 细胞，这一方法随后彻底改变了抗原特异性 T 细胞群体的分析技术。

目前已证实，TCR 与 pMHC 结合所需的亲和力高于激活 T 细胞所必需的水平。这种亲和力阈值的差异意味着，传统的 pMHC 四聚体染色可能无法检测到具有功能的 T 细胞。尤其是在利用 pMHC 多聚体染色自身反应性（抗肿瘤及自身免疫）T 细胞群体时，这种低亲和力 TCR 特异性 T 细胞未能被染色的问题尤为突出，因为这些细胞通常表达较低亲和力的 TCR。

此外，当染色 pMHCII 限制性 T 细胞时，这一问题更加严重，因为与 CD8 分子不同，CD4共受体并不能协同促进 TCR 与 pMHC 的结合。使用 pMHCII 四聚体进行体外染色时，可能低估抗原特异性 CD4+ T 细胞群体的程度。研究发现，在多克隆 CD4+ T 细胞应答过程中，存在大量低亲和力的 pMHCII 四聚体阴性效应细胞；同时表明，针对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（35 – 55）和淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒糖蛋白（61 – 80）的 CD4+ T细胞群体，分别被 pMHCII 四聚体染色低估了 8 倍和 4 倍。此外，进一步证实，从恶性黑色素瘤样本中分离出的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）群体中，大部分 Melan A 特异性 CD8+T 细胞并未被传统 pMHC 四聚体染色检测到。而从这些 TIL 中分离出的、常规 pMHC 四聚体染色未能着色的 T 细胞克隆，却能高效杀伤自体肿瘤细胞，这表明 pMHC 四聚体错失了部分功能完全的特异性 T 细胞。

《实战宝典》详细分析了pMHC染色抗原特异性T细胞的主要障碍，并提供了细致可行对的优化方法，供桂芎生物的pMHC四聚体采购用户参考。