抗原特异性T细胞扩增与检测服务

服务价值

从PBMC中刺激出抗原特异性T细胞，本服务将交付刺激后细胞、流式检测试剂、抗原肽、流式鉴定报告。

服务内容

  1. 使用抗原肽刺激目标MHC的PBMC连续14天培养扩增，期间添加包含所需细胞因子、培养基、血清、抗生素。
  2. 每隔一天细胞状态拍照记录(10x 40x物镜放大倍率)，并将照片提供给用户监控。
  3. 收获细胞后，通过pMHC复合物荧光四聚体、抗CD8流式荧光抗体，使用流式检测抗原特异性T细胞数量(含阴性未刺激组作为对照检测)。
  4. 生产抗原肽MHC复合物荧光四聚体，用于流式检测，涉及的MHC类型覆盖MHC-I型56种，MHC-II型18种。覆盖物种为：人、小鼠、恒河猴、大鼠。

用户提供

  1. 抗原肽>1mg 粉剂，并提供溶剂名称。若为多肽溶剂，须标明浓度。若客户无抗原肽，可提供多肽信息，由我方合成；
  2.  默认使用PBMC中单核细胞分化后的树突状细胞呈递抗原肽，用户无须提供PBMC，PBMC由我方提供。若用户需要特定患者的PBMC作为呈递细胞，须用户自主提供患者PBMC，且需要告知HLA类型（或有我方代为检测）。
  3. 若用户需要特定肿瘤细胞系呈递抗原肽，可提供肿瘤细胞系，并标识肿瘤细胞系的HLA类型。若无HLA类型，可告知肿瘤细胞系名称。对用户提供的肿瘤细胞，我方将免费刺激、流式检测一次。

交付标准

  1. 交付pMHC荧光四聚体，供用户完成从10的7次方PBMC中检测、分选抗原特异性T细胞；
  2. 交付刺激后的PBMC，至少含5000个抗原特异性T细胞，可供用户完成单细胞级TCR测序；
  3. 检测报告 (可扫描页面下方客户技术经理二维码索取demo版报告)，并提供流式检测原始结果;
  4. 若用户未提供抗原肽，我方将交付给用户抗原肽，供用户留存使用。

服务周期

  • 用户提供多肽，周期为14天
  • 我方提供多肽，周期为28天

桂芎提供本服务的核心能力

  • 具有成熟优化的抗原特异性T细胞刺激流程。该刺激流程已经过大量项目验证，同时也是我方pMHC荧光四聚体阳性细胞成熟生产流程。
  • 具有抗原肽-MHC复合物荧光流式检测试剂的合成能力，目前已成功合成5100种抗原肽-MHC复合物荧光流式检测试剂。

实测结果

抗原特异性T细胞活化的服务中，需要如下结果以保证抗原特异性活化：1、抗原特异性T细胞被四聚体标记；2、去除所有悬浮细胞后，仍可见未成熟的DC贴壁。

1、抗原特异性T细胞被四聚体标记

活化的抗原特异性T细胞(以CD8+ T细胞为例)，在早期活化情况下，需要同时为四聚体阳性和CD69阳性。确认抗原肽具有诱导出抗原特异性T细胞的前提是须与无肽刺激的对照组相比较，该对照组使用的所有活化条件须与肽活化组一致，唯一不同的是未加抗原肽。活化过程中，对照组中DC成熟也会活化T细胞。但由于没有抗原肽，活化的T细胞是广谱的而非抗原肽特异性的。因此对照组T细胞的CD69+细胞应该与刺激组比例相近。

肽刺激组和对照组的主要差别在于pMHC四聚体阳性T细胞比例，肽刺激组高而对照组低（多数情况）。值得注意的是，对照组中仍然存在pMHC四聚体阳性细胞，其主要来源为与pMHC具有交叉反应TCR的T细胞。

抗原特异性T细胞使用pMHC四聚体和CD69进行流式检测。
肽刺激组和对照组均使用抗人CD8-FITC抗体、7-AAD、抗人CD69-APC抗体、pMHC-PE荧光四聚体标记所有PBMC中的悬浮细胞。圈门单细胞群后，选择CD8+ / 7-AAD-细胞分群后，进一步圈门CD69+/CD8+活细胞群(注意，无论是否添加肽刺激，CD69+/CD8+T细胞占CD8+T细胞比例约40%)。而后，从CD69+/CD8+活细胞群活细胞群中圈门pMHC PE四聚体(TET)。

2. 残留未成熟DC的荧光成像

成熟DC和T细胞均为悬浮状态，流式检测\分选(或单细胞测序)后，原培养体系中仅存贴壁细胞。此时，观察贴壁细胞状态可以判断DC分化过程中，是否出现高溶酶体状态。相比于成熟DC，未成熟 DC 的溶酶体含量更高，主要是因为它们处于“抗原捕获与储存”阶段：需要大量吞噬囊泡、内体/溶酶体样区室来容纳、暂存和处理持续摄入的抗原。 成熟 DC 则从“采样”转向“呈递”，溶酶体系统会发生重组，更多 MHC II 被转运到细胞表面，部分溶酶体相关区室转化为 MDL 等结构，因此不再以大量储存型溶酶体为主。
 
  1. 未成熟 DC 需要高容量内吞/溶酶体系统
    未成熟 DC 高表达 FcR、甘露糖受体、TLR 等，巨胞饮和吞噬活性很强，会不断把外周抗原吞入细胞内。 这些抗原进入后主要停留在内体/溶酶体样区室中，因此细胞内溶酶体相关囊泡较多。
  2. 未成熟 DC 的溶酶体降解相对“慢”
    未成熟 DC 的内体/溶酶体 pH 相对较高，V-ATPase 活性和蛋白酶活性较弱，所以抗原被缓慢降解，甚至可较长时间以较完整形式保留在细胞内。 这种“低降解压力”有利于抗原积累，也会让溶酶体样区室显得更丰富。
  3. 成熟 DC 溶酶体功能被激活，但区室发生重组
    成熟过程中，DC 上调 V-ATPase，溶酶体酸化增强，组织蛋白酶等水解酶活性提高，抗原被更有效地切割成适合装载到 MHC II 的肽段。 同时，MHC II 从 MIIC/溶酶体区室大量转运到质膜，溶酶体系统从“储存型”转向“加工—呈递型”。
  4. 成熟 DC 内吞能力下降，溶酶体负荷降低
    成熟 DC 的巨胞饮和非特异性内吞显著下降，新抗原摄入减少，溶酶体需要处理的“ incoming cargo ”变少。 因此细胞内不再维持大量用于持续采样的溶酶体囊泡。

溶酶体内源性荧光物质最活跃、最常用的激发波长在 350 nm ～ 450 nm 之间可通过宽场荧光显微镜观察。

对抗原特异性T细胞活化过程中DC的状态提供直观形象。
抗原特异性T细胞活化过程中的未成熟DC以及部分巨噬细胞，溶酶体自发荧光。在完成DC分化和成熟，去除了所有悬浮细胞后的荧光/明场照片。图中方框标记的部分可用于细胞在对比明场和荧光场位置。

应用案例

1.通过HLA特异性K562呈递细胞受抗原肽刺激后，与T细胞共孵育，分离那些识别呈递细胞的T细胞受体序列，并通过临床验证确定了肿瘤新生抗原特异性TCR

T cell antigen discovery via trogocytosis. Nat Methods. 2019

2. 针对抗原特异性TCR改造后细胞毒T细胞，T2细胞用于监控这些CTL对胰腺导管癌抗原的反应

Ex Vivo PD-L1/PD-1 Pathway Blockade Reverses Dysfunction of Circulating CEA-Specific T Cells in Pancreatic Cancer Patients. Clin Cancer Res. 2017

3. 通过呈递细胞表达的肿瘤抗原肽，判断TCR样抗体的结合能力

TCR-like antibody drug conjugates mediate killing of tumor cells with low peptide/HLA targets. MAbs. 2017

4. 胞内抗原特异性CAR-T细胞攻击人工抗原呈递细胞，该人工抗原呈递细胞特异性表达胞内抗原+MHC复合物

CAR-T cells targeting a nucleophosmin neoepitope exhibit potent specific activity in mouse models of acute myeloid leukaemia. Nat Biomed Eng. 2020

5. 呈递p53突变抗原与野生型抗原的HLA-A2型人工抗原呈递细胞，被双特异性单链抗体特异性杀伤。人工抗原呈递细胞作为双特异性单链抗体杀伤效应的监控细胞。

Targeting a neoantigen derived from a common TP53 mutation. Science. 2021

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