信号灯的组成
信号灯也称为signaling andantigen-presenting bifunctional receptors,SABRs,这是一种人工合成的跨膜蛋白,胞外部分就像一个触角,可以与TCR牵手(参考文献见文末)。
这个触角由多肽-B2M-MHC构成。SABRs的胞内部分有CD3ζ结构域。SABRs转入NFAT-GFP-Jurkat细胞,只要T细胞表面受体和这个蛋白结合,就会触发信号灯GFP。然后转染NFAT-GFP-Jurkat细胞。
当T细胞与表达不同候选抗原的靶细胞混合在一起培养时,只有当TCRs和某些候选抗原结合时候,靶细胞通过CD3ζ传递信号并表达GFP信号。
最后,对被分离出来的细胞中编码抗原的基因片段进行测序,就可以找到被TCRs识别的抗原,并对它们的特征进行进一步研究。

信号灯功能的验证
为验证该策略用于筛选抗原的有效性,研究者在NFAT-GFP-Jurkat细胞中分别转染MART1-HLA-A2-SABRs及KK10-HLA-B27-SABRs,这两种细胞是呈递细胞。
同时,构建两种抗原以及阳性对照 (SLYNTVATL-HLA-A2)的TCR-T,MART1-HLA-A2抗原对应TCR克隆命名为F5,KK10-HLA-B27抗原对应TCR克隆命名为EC27,阳性参照抗原对应的TCR克隆为SL9,以上TCR均转入Jurkat细胞,构建为TCR-T。
验证结果显示,只有同源抗原和TCR之间结合,才能引起NFAT-GFP-Jurkat细胞的激活,从而验证该方法的特异性。

抗原空载能否激活信号灯?
然而,筛选抗原前并不一定确定哪些肽段可以被识别,因此有必要测试未装载肽的MHC是否可以被识别。
empty-SABRs就是未装载肽段的MHC复合物,当表达empty-SABRs的NFAT-GFP-Jurkat细胞共孵育MART1或KK10多肽时,并与表达F5或EC27-TCRs的Jurkat细胞共培养, NFAT-GFP-Jurkat细胞同样也能诱导GFP信号。
大规模筛选的可行性
将上述过程反过来,假设抗原是未知的且抗原肽位于一个池子里,在此池子被定义为SABR文库,文中设计了1.2万种多肽。F5-Jurkat细胞是已知抗原MART1的TCR,使用信号灯方法筛选SABR文库,筛选获得的前6个表位就包含MART1。
如果手头上有一对TCR序列,就可以使用这种方法进行大规模筛选了。具体过程案例如下:
1、首先,研究者从一名黑色素瘤患者体内获得抗原特异性肿瘤反应neoTCR,该TCR可识别USP7蛋白中的非同义突变。
2、据患者肿瘤中发现的108个非同义突变,构建了含有3251种HLA-A*0201限制性多肽的neoAg-SABR文库。
3、将表达neoAg-SABR文库的NFAT-GFP-Jurkat细胞与neoTCR-Jurkat细胞共培养,根据GFP+和CD69+将细胞进行分类。
4、而后对抗原表位进行排序,neoTCR分类中前7位是来源于USP7,并且转染neoTCR的原代T细胞能够特异性地杀死该7个新抗原所相对应的靶细胞。
总结
SABRs是结合抗原表达和细胞内信号传导的模块化蛋白质,因此可以成功检测到TCR-PMHC相互作用,为TCR同源抗原发现提供一个平台。
该方法还可用于病原体反应性或自反应性TCR的抗原发现,有助于发现自身免疫性CD4+T细胞和调节性T细胞的抗原。
除了抗原发现,SABRs还可以用于TCR交叉反应或是用于治疗自身反应性疾病。例如,用SABRs转染初级T细胞,可与自身激活的T细胞自相残杀,从而消除免疫激活效应。总之,SABRs可作为用于抗原发现的多功能和强大的工具,其简单性和可扩展性将极大地促进免疫疗法的发展。