什么是单克隆TCR测序
什么是单克隆：“单克隆”指来源于同一个祖细胞的所有子代细胞，它们具有完全相同的TCR alpha链和beta链序列，识别同一个抗原表位。“TCR的单克隆”在不同语境下的含义:
- 科研/治疗开发角度：分离或工程化特定的单克隆TCR，用于：
-
- 构建TCR-T细胞疗法（将识别肿瘤抗原的单克隆TCR基因导入患者T细胞）；
- 研究特定致病性T细胞克隆（如在自身免疫病中）的功能。
2. 从病理学/临床诊断角度：
-
- 在T细胞淋巴瘤等疾病中，肿瘤性T细胞是由一个异常T细胞扩增而来，其TCR基因重排呈现单克隆性（即所有肿瘤细胞有相同的TCR重排序列）。
- 这与正常多克隆T细胞群体（TCR高度多样）形成鲜明对比，因此检测TCR是否为单克隆是诊断T细胞恶性肿瘤的重要依据。
单克隆TCR测序就是对每种单克隆T细胞中配对TCR alpha链和beta链序列测定后，展现出构成TCR的完整V(D)J-C区的核酸序列。由于TCR序列在个体中的高度多样性，获得的TCR配对的TCR alpha链和beta链序列是一个数量在10^2-10^6之间的序列数据库。若这些T细胞是通过pMHC多聚体分选出的，则能看到结合pMHC多聚体最主要的TCR克隆(天然TCR alpha链和beta链配对)，此时TCR的克隆种类约为10^2-10^3之间。
单克隆TCR测序的基本原理
单克隆TCR测序使用了多模态技术叠加方式完成，以标准化、模块化方式组合如下技术：
- 液滴生成技术
- 乳液PCR技术
- 微反应体系内融合基因扩增技术
- NGS文库构建与UMI引导的片段拼接技术
单克隆TCR测序后会获得什么？
单克隆TCR测序核心价值在于：可解析出相同克隆T细胞免疫应答的特异性、克隆动态，具体包括：
- 每个T细胞的完整α/β链天然配对信息（这是识别抗原的关键）
-
- TCR alpha链的V区、J区、C区基因名称，CDR3区域核酸序列和氨基酸序列，并去除CDR3区域出现终止子的克隆；
- TCR beta链的V区、D区、J区、C区基因名称，CDR3区域核酸序列和氨基酸序列，并去除CDR3区域出现终止子的克隆；
-
- 同一克隆（即拥有相同TCR）的T细胞是否扩增，输出结果是每种克隆的克隆数量，即配对的TCR alpha链和TCR beta链克隆数量。在pMHC多聚体分选的T细胞中，该克隆数量丰度最高的TCR是抗原反应的主要后续克隆。
检测服务所需用户提供：
- 每样本活T细胞数量 >1*105(约PBMC>4*105)，-80度无血清冻存液保存，或液氮含血清冻存液保存。冻存细胞到达我方细胞实验室后，我方将复苏24h后开始检测。
- 抗凝全血常温48h以内(含运输时间)，全血样本到达我方细胞实验室后，我方提取PBMC后开始检测。
交付结果
- 每个样本的fastq原始数据(测序数据量>50M reads)
- 每克隆配对的a链和b链，其中a链含V-J-C区基因名称+CDR3序列，b链含V-(D)-J-C区基因名称+CDR3序列
- 每种TCR的克隆数
单克隆TCR测序的开发指标
实测模型设置为：通过上样18万个T细胞，采集180万液滴作为测试过程，使用视觉智能做质量监控，完成以下测试：
1. 视觉智能下液滴生成过程
该视频显示了细胞与PCR反应体系被液滴包裹时的光场、荧光场视觉智能监控过程，其中视频上端为监控参数，左下为液滴生成的光场高速摄影记录，右下为智能识别光场下液滴侧向面积、光亮度、液滴数量实测曲线图。
2.液滴生成平均面积计算。统计每群面积近似的液滴数量，通过柱状图展示不同液滴侧向面积的数量差别，不同液滴面积差距越小、数量差别越小越好。下图是统计单次液滴生成时，不同液滴面积的液滴数量统计图。
3.液滴生成过程中双细胞率、空载细胞生成统计。通过FAM、JOE荧光计算双细胞标记，通过FITC和DAPI荧光计算液滴空载细胞比例。
