▲ 研究工作流程：从PDAC患者获取肿瘤组织和T细胞 → 构建自体类器官 → T细胞-类器官共培养 → 分选激活的T细胞（CD137+）→ 单细胞RNA/TCR测序 → 获得配对的肿瘤反应性TCR序列。
胰腺导管腺癌（PDAC）是实体瘤免疫治疗领域公认的“珠穆朗玛峰”。 其致密的基质屏障、高度免疫抑制的微环境，以及最关键的一点——缺乏可被广泛靶向的共享新抗原，使得包括CAR-T和传统TCR-T在内的多种疗法在此屡屡受挫。近日，一项发表于《Cancer Letters》的突破性研究，提出了一种颠覆性的“抗原/HLA无关（Antigen/HLA-agnostic）”策略。该策略巧妙地绕开了对抗原肽和患者HLA类型的先验知识需求，通过将患者的T细胞与其自体肿瘤类器官（Autologous Organoid）进行功能性共培养，直接捕获那些能被真实肿瘤激活的T细胞，并利用单细胞测序技术，精准获取其配对的T细胞受体（TCR）序列。这一方法为个体化TCR-T疗法的开发，尤其是在PDAC等“冷肿瘤”中，点亮了一盏明灯。
肿瘤反应性T细胞受体（TCR）的鉴定是个性化TCR-T细胞疗法的关键步骤，但对于胰腺导管腺癌（PDAC）而言，这一过程仍充满挑战。该研究报告了一项概念验证研究，利用超深度单细胞TCR/RNA测序和自体类器官技术，成功鉴定了两名代表性PDAC患者的抗肿瘤TCR并进行了验证，并揭示了同一患者不同T细胞扩增过程中TCR库的表型动态变化。该研究首先对新鲜采集的外周血单个核细胞（PBMCs）与未培养的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）进行了比较测序，随后以自体类器官为靶标，对富集自TILs的TCR进行了反应性检测。
该研究鉴定了两种肿瘤反应性TCR，这些TCR对应的TILs主要为组织驻留的记忆样T细胞，部分同时表达初始T细胞和耗竭T细胞的标志物。对于一位未能获得高质量TILs的PDAC患者，该研究采用新抗原肽（KRAS G12D）、类器官或抗CD3抗体进行PBMC培养，并在培养十天内观察到显著的克隆扩增现象。所有培养所得的PBMC均进行了平行测序（超过82,000个细胞），其中，在经历肽刺激和类器官刺激但未接受抗CD3处理的CD8 T细胞中富集的TCR被进一步评估其对抗原呈递细胞（APC）和类器官的反应性。最终，该研究鉴定了三种新抗原反应性TCR，它们均表现出肿瘤反应性特征，对应的T细胞则呈现出混合转录组特征，包括但不限于典型的耗竭T细胞标志物。综上所述，超深度单细胞测序与类器官技术的结合，能够快速鉴定肿瘤反应性TCR，从而为开发无抗原/人类白细胞抗原（HLA）限制性的实用化个性化TCR-T疗法提供了可能。
第一章：PDAC免疫治疗的困境与传统TCR发现的局限
TCR-T细胞疗法的成功，高度依赖于能否找到一个理想的TCR：它既能高亲和力、高特异性地识别肿瘤细胞表面的pMHC复合物，又不会与正常组织发生交叉反应。
传统的TCR发现路径主要有两条：
- 基于已知抗原的筛选
利用荧光标记的pMHC多聚体（如四聚体）从患者TILs或外周血中直接分选出特异性T细胞。这种方法的前提是必须预先知道目标抗原肽及其对应的HLA限制性。然而，在PDAC中，驱动突变（如KRAS G12D/V/R）虽普遍，但由其产生的新抗原具有极强的HLA等位基因限制性和个体独特性，几乎不存在适用于超过10%患者的“公共新抗原”。 - 基于HLA的预测与验证
通过全外显子组测序鉴定肿瘤突变，再结合患者的HLA分型，利用算法预测潜在的新抗原。然后合成这些肽段，用以刺激T细胞或验证TCR活性。此方法计算量大、假阳性率高，且严重依赖于预测算法的准确性，对于翻译后修饰、非经典呈递等复杂情况束手无策。
这两种方法都陷入了同一个死胡同：它们都需要一个明确的“靶点假设”。而在PDAC这个靶点模糊、异质性极高的肿瘤面前，这种“先有鸡还是先有蛋”的困境，极大地阻碍了有效TCR的发现。
第二章：革命性策略——“以瘤寻T”的功能导向筛选
新发表的这项研究，其核心思想是彻底摒弃“靶点假设”，转而采用一种“功能导向”的筛选逻辑：让肿瘤自己来告诉我们，哪些T细胞是它的“天敌”。
为了实现这一目标，研究者构建了一个高度仿生的体外系统，其关键组件是自体肿瘤类器官（Autologous Tumor Organoid）。类器官是从患者新鲜肿瘤组织中分离出的干细胞或祖细胞，在特定3D培养条件下形成的微型器官。它能够：
-
高度保留原代肿瘤的组织学结构、遗传特征和细胞异质性。 -
持续表达患者肿瘤特有的、未经人为干预的全部抗原谱（包括已知和未知的）。 -
提供一个比2D细胞系更接近体内真实微环境的交互平台。
完整的实验流程如下：
- 样本采集与处理
同步获取PDAC患者的手术切除肿瘤组织、外周血单个核细胞（PBMCs）以及肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。 - 自体类器官构建
从肿瘤组织中成功建立并扩增出稳定的PDAC类器官系，并通过病理和分子检测确认其保真度。 - T细胞-类器官共培养
将患者来源的T细胞（TILs或经预激活的PBMCs）与自体PDAC类器官进行长时间（通常5-7天）的3D共培养。在此过程中，只有那些TCR能识别类器官上肿瘤相关抗原的T细胞才会被特异性激活、增殖。 - 激活T细胞的富集
共培养结束后，使用流式细胞术分选出活化的T细胞亚群。常用的激活标志物包括CD137（4-1BB）、CD69或OX40。这些标志物的上调是T细胞被其特异性抗原成功激活的直接证据。 - 单细胞多组学测序
对富集到的激活T细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），同时捕获其配对的TCRα和TCRβ链的全长序列。这一步不仅能获得TCR序列，还能同步分析T细胞的功能状态（如效应、记忆、耗竭等）。 - 候选TCR的鉴定与验证
通过生物信息学分析，鉴定出在激活T细胞中显著富集的TCR克隆型。随后，将这些TCR克隆到报告T细胞系中，回输并与自体类器官共培养，最终验证其特异性的杀伤功能。
第三章：策略优势与深远意义
这一“抗原/HLA无关”策略具有三大核心优势：
- 无偏倚性
它不依赖于任何先验知识，能够发现针对未知抗原、非经典呈递抗原甚至翻译后修饰抗原的TCR，极大地拓宽了靶点发现的视野。 - 生理相关性
类器官作为天然的抗原呈递平台，其呈递的抗原谱是内源性的、经过自然加工的，因此筛选出的TCR在后续体内应用时，成功率更高。 - 个体化精准医疗
该策略天然适用于个体化治疗。每个患者都能获得一套针对其自身独特肿瘤抗原谱的TCR库，为真正意义上的“量体裁衣”式细胞治疗铺平道路。
第四章：挑战、展望与桂芎的使命
尽管前景广阔，该策略仍面临挑战：类器官建系的成功率和周期、共培养体系的标准化、以及高昂的成本。然而，随着技术的不断成熟，这些问题正在被逐一攻克。
未来，这一平台有望与新抗原预测、TCR亲和力成熟、通用型T细胞底盘等技术相结合，形成一个更加强大的个体化细胞治疗开发引擎。
桂芎生物的使命，正是成为这一变革浪潮中的核心赋能者。 我们不仅提供尖端的技术服务，更致力于与合作伙伴共同探索，将最前沿的科学构想，转化为能够真正惠及患者的创新疗法。因为我们深知，在与“癌王”PDAC的战斗中，每一个被成功挖掘的TCR，都可能是一位患者重获新生的希望。
原文信息：Antigen/HLA-agnostic strategies for Characterizing Tumor-responsive T cell receptors in PDAC patients via single-cell sequencing and autologous organoid application. Cancer Letters, Volume 586, 28 February 2024, 137134.
如何将转化为研究成果？
桂芎生物可提供关键产品支撑：
1. 微量pMHC复合物合成服务: 支持HLA-A*02:01等33种主流HLA等位基因，用于抗原特异性T细胞验证
2 . pMHC荧光四聚体合成以及筛选: 现货覆盖多种肿瘤抗原（如HPV/CMV/EBV/KRAS等），快速分选抗原特异性T细胞
3. 工程化呈递细胞构建: K562-HLA系列，模拟体内抗原呈递，用于DC功能模拟
4. 单克隆TCR测序: 从四聚体阳性T细胞中获取配对链的TCR主克隆
5. 抗原肽-MHC亲和力高通量ELISA扫描服务: 高通量筛选最优表位，指导DC疫苗设计
6. 抗原特异性T细胞扩增: 桂芎拥有稳定的抗原特异性DC的分化成熟工艺，是抗原特异性T细胞扩增和检测的基石。
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